المقدمة

تنتمي الحمضيات الى العائلة السذبية Rutaceae وتشمل العديد من الأجناس أهمها الجنس Citrus وهو من أهم الأجناس من الناحية الاقتصادية ، ويضم اربع مجاميع هي مجموعة البرتقال ومجموعة اللالنكي(اليوسفي)  ومجموعة الليمون الهندي والمجموعة الحامضية وتضم كل مجموعة العديد من الأنواع التي تشتمل على العديد من الأصناف والسلالات ، وكذلك الجنس Poncirus ومن أهم أنواعه البرتقال الثلاثي الاوراق والجنس Fortunella ومن اهم انواعه الكمكوات (3 و  15 ).أزدادت أهمية زراعة الأنسجة النباتية بوصفها احدى اهم الوسائل المستخدمة في اكثار النباتات وتحسينها كماً ونوعاً ( 6).ان الجهود المكثفة التي أجراها العلماء اكدت ان تقانة زراعة الانسجة النباتية التي استخدمت في البدء كأداة اصبحت علماً تطبيقياً واسع المجال، يطبق في مجالات عديدة ، اذ استخدم للاكثار الدقيق للعديد من النباتات في مدة زمنية قصيرة وعلى مدار السنة او لأنتاج نباتات متحملة للعوامل البيئية المختلفة في مجال تربية النباتات وتحسينها او لأنتاج المركبات الثانوية المهمة في الصناعات الدوائية ، وحفظ المصادر الوراثية فضلاً عن انتاج نباتات خالية من المسببات المرضية ولاسيما الفايروسية منها، كما تعد تقنيات زراعة الانسجة النباتية نظاماً مهماً في الدراسة الكيموحيوية والفسلجية بتوفيرها للعديد من المعلومات في العلوم الرئيسة كعلم الخلية وفسلجة النبات ، وعلم الوراثة وتربية النبات وعلم الكيمياء الحياتية وعلم امراض النبات ، وعلم تشريح النبات ، ويعد الاكثار الدقيق من اكثر التطبيقات العملية لزراعة الأنسجة النباتية في الوقت الراهن (17). الاوكسينات عبارة عن مجموعة من الاحماض العضوية ذات الأوزان الجزيئية العالية، وتستخدم بتراكيز قليلة جداً لتحدث تأثيراً كبيراً في الجزء المزروع . وهناك العديد من الاوكسينات منها 2,4-D و NAA ، والاوكسين الطبيعي IAA و IBA (11). والاوكسينات مسؤولة عن استطالة الخلايا وتطور الاعضاء او تكوينها  ((14 ، اما السايتوكاينينات فهي عبارة عن قواعد نتروجينية ذات أوزان جزيئية عالية تعطي بالتراكيز الواطئة تأثيرات فسيولوجية عديدة ، وتؤدي السايتوكاينينات دوراً كبيراً في زراعة الانسجة النباتية اذ انها تشجع على انقسام الخلايا النباتية وتمايزها ونمو البراعم الابطية (8). و تعد البراسينوستيرويدات (BRs) من منظمات النمو النباتية اضيفت الى المجاميع الخمس المعروفة من منظمات النمو (الاوكسينات والسايتوكاينينات والجبريلينات والاثلين وحامض الابسيسيك) . وتم استخدامها حديثاًَ في مجال زراعة الانسجة النباتية، فهي ذات تأثيرات فسلجية في استطالة وانقسام الخلايا وتمايز الاوعية الناقلة( 13و10)

قسم   ( 10) مراحل الاكثار خارج الجسم الحي الى خمس مراحل :

1-        مرحلة الصفر Zero stage او مرحلة التحضير Preparation stage

2-        مرحلة نشوء الزروعات Initiation stage

3-        مرحلة التضاعف     multiplication stage

4-        مرحلة التجذير         Rooting stage 

5-       مرحلة الأقلمة  Acclimatization stage

 المواد وطرائق العمل

تحضير الاجزاء النباتية

            تم اختيار أقلام ساقية غضة بطول 5 سم من شتلات التروير سترانج البالغة من العمر 6 اشهر والمزروعة في اكياس بلاستيكية سعة 2 كغم، ومنماة في الظلة الخشبية التابعة لقسم البستنة. نقلت الاجزاء النباتية الى المختبر وتركت تحت الماء الجاري مدة نصف ساعة أعقبها الغسل بالماء والصابون السائل للتخلص من الاتربة والمواد العالقة بها، بعد ذلك ازيلت الاوراق والاشواك وقسمت الى الأجزاء الاتية التي استخدمت كعينات  .

أ– اطراف الأفرع Terminal shoots   و بطول 1.5 سم.

ب–  أقلام ساقية ذات عقدة واحدة   Single Node Cuttings   بطول 5. 1 سم

تم اختيارها من المنطقة الوسطية للفرع، للحصول على براعم جيدة الحجم ثم نقلت الى كابينة انسياب الهواء الطبقي للمباشرة بعملية التعقيم السطحي.تم اختبار تأثير هايبوكلورات الصوديوم NaOCl (محلول القاصر التجاري فاس تركيز 6%) وحضرت منه التراكيز (0 – 1.5 – 3 – 4.5 او 6%) غمرت فيها الأجزاء النباتية لمدة 10 دقائق  مع التحريك المستمر، بعدها غسلت العينات  بالماء المقطر المعقم ثلاث مرات، لازالة تأثير المعقم، بعدها نقلت الى اطباق بتري معقمة لاستئصال القمم النامية والعقد ، وتم استخدام 10 مكررات لكل معاملة  وبمعدل انبوبة أختبار لكل مكرر. وسجلت النتائج عن نسبة التلوث بعد 7 أيام من الزراعة  بعد اكتمال عملية التعقيم السطحي نقلت الأجزاء النباتية وبصورة منفردة الى اطباق بتري المعقمة في منضدة الزراعة . ثم قطعت نهايات العقد التي ربما قد  تضررت من اثر استخدام المادة المعقمة ، اما اطراف الأفرع فتم قطع النهاية السفلى فقط بحيث اصبح طول العينات (اطراف الأفرع والعقد) 1 سم .

استخدم الوسط الغذائي MS (16) في مراحل الاكثار كافة واضيف اليه منظمات النمو وكانت المعاملات المستخدمة كالأتي :

1-   في مرحلة تنشأة الزروعات تمت دراسة تأثير 2 ملغم / لتر  BA + 40 ملغم / لتر كبريتات الادينين + 0.2 ملغم / لتر GA₃   (2)  على مدىاستجابة الأجزاء النباتية المزروعة.

2-   في مرحلة التضاعف تم دراسة تأثير التداخل بين الـ  BA   بالتراكيز (0 ، 1 ، 1.5 ، 2 و 2.5) ملغم / لتر و الـ IAA بالتراكيز (0 ، 0.1 ، 0.2 و 0.4) ملغم / لتر .

3-   في مرحلة التجذير اضيف الـ NAA بالتراكيز (0 ، 1 و 2) ملغم / لتر  بالتداخل مع (Brassinolide) BL بالتراكيز (0 ، 0.048 و 0.096) ملغم / لتر .

وزعت المعاملات في انابيب الزراعة بواقع 10 مل لكل انبوبة، وجرى تعقيمها باستخدام الموصدة على درجة حرارة 121 ْم وضغط 1.04 كغم / سم² لمدة 15 دقيقة.

أستناداً الى النتائج المتحصل عليها من تجارب مرحلة النشوء أستخدمت الأفرع الناتجة  من نمو العقد  في تجارب التضاعف، اذ قطعت الافرع الخضرية بطول 2 سم  وزرع فرع واحد في كل انبوب ، وبواقع عشر مكررات لكل معاملة اذ عد كل انبوب مكرراً واخذت القياسات بعد 6 اسابيع من الزراعة .

  تم أخذ الأفرع  الناتجة من مرحلة التضاعف وزرعت على اوساط التجذير سجلت البيانات بعد 6 اسابيع من الزراعة .وحضنت الزروعات في مراحل الأكثار كافة على درجة حرارة 25 + 2 ْم و شدة اضاءة 1000 لوكس لمدة 16 ساعة ضوء و 8 ساعات ظلام.

           اختيرت النبيتات المتجانسة التي تم الحصول عليها من مرحلة التجذير ونقلت الى اوساط زرعية لغرض الاقلمة . اذ استخرجت النبيتات من اوعية الزراعة وغسلت بماء الحنفية للتخلص من بقايا الاكار الملتصق بجذورها  ، بعدها غمرت النبيتات لمدة 10 ثوان بمحلول مبيد البيلتانول (مبيد فطري بكتيري) بتركيز 1 مل / لتر لوقايتها من الاصابة الفطرية.وزرعت النبيتات في أصص بلاستيكية بقطر5سم  مملوءة بوسط مكون من البيتموس

والمزيج بنسبة 1: 1 والمعقم بجهاز الموصدة على درجة حرارة 121 ْم وضغط 1.04 كغم / سم²  لمدة 20 دقيقة واعادة تعقيمها في اليوم الثاني لمدة 20 دقيقة ايضاً لضمان التخلص من المسببات المرضية ، 

غطيت الأصص بأغطية بلاستيكية شفافة، وحضنت في غرفة النمو تحت  نفس الظروف البيئية التي حضنت عليها العينات  المزروعة . وبعد مرور اسبوعين من الزراعة ، تم فتح الأغطية بصورة تدريجية مع مراعاة السقي بمحلول MS بربع قوةتركيز املاحه، وبعد مرور 4اسابيع نقلت الى البيت الزجاجي ورفعت الأغطية البلاستيكية نهائياً .   

 أستخدام التصميم العشوائي الكامل Completely Randomized Design (CRD) وبتجارب عاملية ، وحللت النتائج باستخدام البرنامج الاحصائي الجاهز SAS(2004) وقورنت المتوسطات على وفق اختبار اقل فرق معنوي (LSD) وعلى مستوى احتمال 5% (1).               

النتائج والمناقشة

تعقيم الأجزاء النباتية

           يبين الجدول (1) كفاءة هايبوكلورات الصوديوم في تقليل نسبة تلوث الأجزاء النباتية اذ بلغت نسبة التلوث  في معاملة المقارنة 100% وانخفضت هذة النسبة الى 25% عند التركيز 3% ، وبلغت نسبة تلوث العقد 30%   أما اطراف الأفرع فقد بلغت نسبة التلوث فيها 20%  وكما اعطى التركيز 3% أعلى نسبة لبقاء الأجزاء النباتية حية في حين ان زيادة تركيز هايبوكلورات الصوديوم  الى (4.5 او 6%) اثرت سلباً في نسبة بقاء الأجزاء النباتية، وأدت الى موتها. وقد يعود سبب ذلك الى ان التراكيز العالية من هايبوكلورات الصوديوم  لها تأثير سمي على الأجزاء النباتية المعقمة (18).

جدول (1). تأثير  هايبوكلورات الصوديوم  في النسبة المئوية لتلوث الأجزاء النباتية لأصل الحمضيات التروير       سترانج. (غمرت الاجزاء النباتية لمدة 10 دقائق)

  تنشئة الزروعات

         اوضحت نتائج  جدول (2 ) ان نسبة استجابة اطراف الأفرع للزراعة خارج الجسم الحي كانت منخفضة مقارنة باستجابة العقد المفردة، اذ بلغت نسبة استجابة العقد المفردة   100% في حين بلغت نسبة استجابة اطراف الأفرع 20%  ،ان سبب اختلاف استجابة الاجزاء النباتية المزروعة في وسط MS المزود ب2 ملغم / لتر  BA + 40 ملغم / لتر كبريتات الادينين + 0.2 ملغم / لتر GA₃   قد يرجع الى التفاوت في قابلية تلك الأجزاء النباتية على بناء هذه الهرمونات داخلياً .  او ربما يعزى السبب في ذلك الى الحالة الفسيولوجية للنبات الأم، اذ تختلف استجابة البراعم لوسط الزراعة باختلاف الحالة الفسيولوجية للنبات الأم (5 و 10 ) .  ولا تتفق هذه النتائج مع 19) و2 و  20) الذين وجدوا ان البراعم الطرفية اكثر استجابة من البراعم الجانبية.

جدول (2). استجابة العقد المفردة واطراف الأفرع المستأصلة من أصل الحمضيات التروير سترانج  المزروعة على وسط MS  المجهز بـ2   ملغم/لتر  BA و  40 ملغم /لتر AdSo₄ 2.0 ملغم /لتر GA3بعد مرور ستة اسابيع من الزراعة.

 مرحلة تضاعف الزروعات

         تشير نتائج الجدول (3 )  ان زراعة افرع  التروير في وسط MS المجهز بـ 1 ملغم / لتر BA اعلى معدل لعدد الأفرع بلغ 3.75 فرع / جزء نباتي الذي اختلف معنوياً عن بقية المعاملات ، وأعطت معاملة المقارنة اقل معدل لعدد الأفرع بلغ 1 فرع / جزء نباتي .  اما عن تأثير تراكيز IAA فتشير نتائج الجدول نفسه الى ان الأفرع  المزروعة على وسط MS المجهز بـ 0.2 ملغم / لتر IAA أعطت أعلى معدل لعدد الأفرع  بلغ 3.00 فرع / جزء نباتي الذي لم يختلف معنوياً عن بقية المعاملات  .وبالنسبة للتأثير المشترك بين تراكيز BA  و IAA ، يلحظ من الجدول نفسه ان افرع التروير المزروعة على وسط MS المزود بـ  1ملغم / لتر BA + 0.2ملغم / لتر IAA قد أعطت أعلى معدل لعدد الأفرع بلغ 5.30 فرع / جزء نباتي الذي اختلف  معنوياً عن المعاملات جميعها وقد يعزى ذلك الى ان فعالية السايتوكاينين في احداث التضاعف تزداد بوجود الاوكسين في الوسط الغذائي (4و  17).أماسبب تفوق BA في معدل عدد الأفرع  ربما يعزى الى  دور السايتوكاينينات في كسر السيادة القمية التي ينتج منها تحفيز نمو البراعم الجانبية الموجودة في أباط الأوراق (9). وأعطت المعاملات التي تحتوي على IAA فقط اقل المعدلات لعدد الأفرع ،و قد يعود سبب ذلك الى دور الاوكسين في تشجيعه السيادة القمية ومنع نمو البراعم الجانبية (4).

جدول (3). تأثيرتراكيز الـ BA والـ IAA والتداخل بينهما في معدل عدد الأفرع المتضاعفة لأصل الحمضيات الترويربعد 6 أسابيع من الزراعة  على وسط MS .

        بينت نتائج الجدول (4) ان الأفرع المزروعة في معاملة المقارنة أعطت أعلى معدل لطول الأفرع بلغ 3.48 سم والذي اختلف معنوياً عن بقية المعاملات.ويوضح الجدول نفسهانهلاتوجد أختلافات معنوية بين تراكيز IAA المضافة ومعاملة المقارنة في معدل أطوال الأفرع.اما عن تأثير التداخل بين تراكيز BA و IAA فقد اعطت الأفرع المزروعة في وسط MS الخالي منBA  والمجهز بـ  0.1 ملغم / لتر IAA اعلى معدل لطول الافرع بلغ 3.95 سم  الذي اختلف معنوياً عن بقية المعاملات. انخفض معدل طول الأفرع بزيادة تراكيز BA أي ان لتراكيز BA في الوسط الغذائي تأثيراً سلبياً في معدل اطوال الأفرع المتكونة على الأجزاء النباتية المزروعة وقد يعود السبب في ذلك الى زيادة  معدل عددالأفرع وزيادة تنافسها على المواد الغذائية الموجودة في الوسط الغذائي مما قلل من معدل اطوالها . و يعزى سبب  تفوق تراكيز IAA  في معدل طول الأفرع الى  قلة عدد الأفرع المتكونة وبالتالي أستفادتها من المواد الموجودة في الوسط الغذائي .

جدول (4). تأثيرتراكيز الـ BA والـ IAA والتداخل بينهما في معدل اطوال الأفرع (سم) المتضاعفة لأصل الحمضيات التروير بعد 6 أسابيع من الزراعة  على وسط MS

مرحلة التجذير  

    أ-تأثير NAAوالبراسينولايد BLفي معدل عدد الجذور

           تبين نتائج الجدول (5) ان الأفرع المعاملة بـ   1ملغم / لتر NAA أعطتاعلى معدل لعدد الجذور بلغ 2.52 جذر الذي لم يختلف معنوياً عن الأفرع المزروعة في وسط MS المزود بـ 2 ملغم / لتر NAA ، وكان اقل معدل لعدد الجذور للأفرع المزروعة في معاملة المقارنة الذي بلغ  0.15 جذر .اما عن تأثير تراكيز BL فيلحظ ان عدم وجود أختلافات معنوية بين تراكيز BLالمضافة الى الوسط الغذائي ومعاملة المقارنة  في معدل عدد الجذور  . وفيما يتعلق بتأثير التداخل بين تراكيز NAA و BL فيلحظ ان الأفرع المعاملة بـ 1 ملغم / لتر NAA +   0.096ملغم / لتر BL  أعطت اعلى معدل لعدد الجذور بلغ 4.89 جذر الذي اختلف معنوياً عن المعاملات جميعها ماعدا معاملة 2ملغم / لتر NAA والخالي من BL والتي بلغت  4.44 جذروبما ان BL بتداخلة مع NAAبالتركيزين المشار اليهما كانا التركيزان المثاليان في اعطاء اعلى معدل لعدد الجذور الذي بلغ 4.89جذر  او قد يعود السبب في ذلك الى ان البراسينوستيرويدات لها تأثير اضافي مع الاوكسينات في تحفيز تكوين الجذور ( 7).

جدول (5). تأثير NAA والبراسينولايد BL والتداخل بينهما في معدل عدد الجذور المتكونة لأصل الحمضيات التروير  بعد مرور ستة اسابيع من الزراعة في وسط MS .

ب- تأثير NAAوالبراسينولايد BLفي معدل أطوال الجذور

            تبين نتائج الجدول (6)  الأفرع  المزروعة في وسط MS المجهز بـ   1 ملغم / لتر NAA  أعطت اعلى معدل لطول الجذور بلغ  7.81 سم على التوالي الذي اختلف معنوياً عن باقي المعاملات  .اما عن تأثير  تراكيز BL فيتبين من الجدول تفوق المعاملة 0   ملغم / لترBL عن بقية المعاملات  اذ بلغ معدل طول الجذور  6.70سم على . وبالنسبة لتأثير التداخل بين تراكيز NAA و BL أعطت الأفرع  المزروعة في وسط MS المجهز بـ 1ملغم / لتر NAA + 0 ملغم / لتر BL اعلى معدل لطول الجذور  بلغ14.89 سم  الذي اختلف معنوياً عن باقي التداخلات الاخرى وقد يعود السبب الى قلة عدد الجذور المتكونة وبالتالي استفادتها من المواد الغذائية الموجودة في الوسط الغذائي ومن ثم زيادة معدل أطوالها قد يرجع السبب في ذلك وقد يرجع السبب في ذلك الى ان التركيز الواطىء من البراسينوسيترويدات يعمل على حث النباتات على تكوين الجذور في حين ان التراكيز العالية لها تؤدي الى تحفيز انتاج الاثيلين وان قسماً من التأثيرات المثبطة لنمو الجذور تعود الى انتاج الاثيلين  كما ان المعاملة ب BL ربما تحفز انتقال الاوكسين قطبياً والذى أدى الى نمو الجذور وتطورها (12).

   جدول (6).تأثير   NAA والبراسينولايد BL والتداخل بينهما في معدل اطوال الجذور (سم) المتكونة لأصل الحمضيات التروير  بعد مرور ستة اسابيع من الزراعة في وسط MS .

           نستنتج من نتائج الجدول ( 7) ان نوع الوسط الزرعي المستخدم في نمو النبيتات له أثر كبير في النسبة المئوية لنجاح النبيتات المتأقلمة ، إذ بينت النتائج تفوق الوسط المكون من المزيج والبتموس بنسبة 1 : 1 معنوياً عن بقية المعاملات  ، اذ بلغت نسبة النبيتات المتأقلمة90 %   في حين بلغت 80و70% عند استخدام الوسط المكون من البتموس والمزيج على التوالي  .ان سبب تفوق الوسط الزرعي المكون من المزيج والبتموس في النسبة المئوية لنجاح النبيتات المتأقلمة قد يرجع الى ان المزيج  يمتلك مسامات جيدة لنمو الجذور وانتشارها ، فضلاً عن كونه  وسط جيد لتصريف الماء ويمنع اختناق جذور النبيتات ، كما إن وجود البيتموس كوسط مغذي مع  وسط جيد التهوية كالمزيج يعتبر جيد وملائم لنمو النبيتات. أما انخفاض النسبة في الوسط المكون من مزيج فقط فيعود الى إن المزيج ذو محتوى قليل من  العناصر الغذائية فضلاً عن كونه  لا يحتفظ بالرطوبة .

 جدول ( 7). تأثير نوع الوسط الزرعي في النسبة المئوية لاقلمة النباتات الناتجة من  مرحلة التجذير   .

 المصادر

1. الساهوكي ، مدحت ووهيب ، كريمة احمد. 1990. تطبيقات في تصميم وتحليل التجارب. وزارة التعليم العالي والبحث العلمي. العراق.
2. العبيدي ، هاشم كاظم محمد والجبوري ، عبدالجاسم محيسن جاسم وعثمان ، اسعد خالد والحسيني ، زينب عبدالجبار حسين. 2001. تأثير البنزل ادنين (BA) في تضاعف اصلي الحمضيات Troyer citrange و Carrizo citrange خارج الجسم الحي. المجلة العلمية لمنظمة الطاقة الذرية ، مجلد 3 ، العدد 1 ، ص 63-73.
3. المنيسي ، فيصل عبدالعزيز . 1975. الموالح ، الاسس العلمية لزراعتها . الطبعة الاولى – دار المطبوعات الجديدة – الاسكندرية.
4. محمد ، عبدالعظيم كاظم واليونس ، مؤيد احمد. 1991. اساسيات فسيولوجيا النبات . الجزء الثالث . كلية الزراعة . العراق. جامعة بغداد.
   1. Altman , A. and R. Goren. 1974. Growth and dormancy cycles in citrus bud cultures and their hormonal control . Physiol. Plant., 30 : 240-245.
   2. Aurelia , S. ; J. Lusarkiewicz ; P. Aleksandro and K. Zygmunt. 2007. Influence of cultivar , explant source on in vitro growth of (Cannabis sativa L.) . Plant Genet., 47 : 145-151.
   3. Bao , F. ; J. Shen ; S.R. Brady ; G.K. Muday ; T. Asami and Z. Yang. 2004. Brassinosteriods interact with auxin to promote lateral root development in Arabidopsis. Plant Physiol. 134 : 1624-1631.
   4. Delloloio , R. 2007. Cytokininus determine Arabidopsis root – meristem size by controlling cell differentiation. Curr. Biol., 17 : 678-682.
   5. Devlin , R.M. and F. H. Witham. 1983. Plant physiology . (4^th ed) Wadsworth Publishing Company Belmont California.